【試劑盒組分】

【試劑盒有效期】

2～8℃避光保存，有效期為12個(gè)月。

【需自備的材料】

微量移液器、量筒、酶標(biāo)儀（450 nm）、去離子水、離心機(jī)（4000 rpm）、恒溫培養(yǎng)箱（25℃）、計(jì)時(shí)器等。

【注意事項(xiàng)】

1.   試劑盒使用前各試劑應(yīng)平衡至室溫（至少40 min），使用后放回2~8℃保存。

2.   不同批號(hào)的試劑盒組份不得混用，不同試劑使用時(shí)應(yīng)防止交叉污染。

3.   底物液不能暴露于強(qiáng)光或接觸氧化劑。

4.   必須使用符合藥典規(guī)定的水（如蒸餾水、去離子水或純水）稀釋洗滌液。

5.   待檢血清數(shù)量較多時(shí)，應(yīng)先稀釋完所有待檢血清，再加到酶標(biāo)板上，使反應(yīng)時(shí)間一致。

6.   終止液為強(qiáng)酸，若不慎濺到皮膚上請立即清洗。

7.   移液時(shí)，應(yīng)盡量準(zhǔn)確，防止產(chǎn)生氣泡。

8.   應(yīng)嚴(yán)格遵守各操作步驟規(guī)定的時(shí)間和溫度。

【操作方法】

一、試劑配制

洗滌工作液：使用前，濃縮的洗滌液應(yīng)恢復(fù)至室溫（20～25℃），并搖動(dòng)，使沉淀溶解（最好在37℃恒溫培養(yǎng)箱中加熱5～10 min），然后用蒸餾水作20倍稀釋（例如：30 mL的濃縮洗滌液加上570 mL蒸餾水）混勻，稀釋好的洗滌液2～8℃可存放7日。

二、樣品處理

1.     取動(dòng)物全血，待血液凝固后，4000 rpm離心10 min，收集上清。也可以自然凝固析出血清，無溶血。

2.     在血清稀釋板中按1:50稀釋陰、陽性對照品和待檢血清樣品（如245 ?L樣本稀釋液中加5 ?L待檢血清樣品），充分混勻。

三、操作步驟

1.     取包被板（根據(jù)樣品多少，可拆開分次使用），將稀釋好的待檢血清取100 ?L加至抗原包被板中。同時(shí)設(shè)陰性對照2孔、陽性對照2孔，取稀釋好的陰性、陽性對照各100 ?L分別加入反應(yīng)孔中，輕輕振勻孔中樣品，蓋上蓋板膜，室溫下（25±2℃）溫育30min。

2.     棄去孔中的溶液，每孔加入稀釋好的洗滌液300 ?L，靜置30 s后，棄去洗滌液。洗滌4次后在吸水紙上拍干（必須充分拍干）。

3.     配制酶結(jié)合物工作液：按體積比1:100（1份酶結(jié)合物濃縮液+99份酶結(jié)合物稀釋液）混勻。

4.     每孔加酶結(jié)合物工作液100 ?L，蓋上蓋板膜，室溫（25±2℃）下溫育30 min。

5.     棄去孔中的溶液，洗滌4次，方法同2。

6.     將底物A液與底物B液按1:1混合均勻，加入孔中，100 ?L/孔，蓋上蓋板膜，室溫下反應(yīng)10 min。

7.     每孔加入終止液50 ?L，5 min內(nèi)測定結(jié)果。

【結(jié)果判定】

在酶標(biāo)儀上讀各孔OD450nm值。

試驗(yàn)成立的條件是：

陰性對照平均OD450nm值＜0.20且陽性對照平均OD450nm值≥1.0，試驗(yàn)結(jié)果才有效；否則，應(yīng)進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。

計(jì)算方法：

陰陽性判斷：

S/P＜0.08時(shí)，判為陰性；S/P≥0.1時(shí)，判為陽性；0.08≤S/P＜0.1，判為可疑。

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