近幾年，隨著非洲豬瘟病毒（African Swine fever virus，ASFV）和新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）在國(guó)內(nèi)依次暴發(fā)，可以滿足人們快速而精準(zhǔn)檢測(cè)需求的real-time PCR方法成為病原檢測(cè)的主流。而核酸提取作為保障病毒核酸檢測(cè)結(jié)果精準(zhǔn)的重要環(huán)節(jié)也備受重視。2020年初，核酸提取市場(chǎng)需求火熱，市面上甚至出現(xiàn)了核酸提取儀一機(jī)難求的局面。巨量的核酸提取市場(chǎng)需求極大刺激各大IVD研發(fā)企業(yè)爭(zhēng)相推出相關(guān)產(chǎn)品。僅僅一年的時(shí)間，在2021年的杭州獸醫(yī)檢測(cè)診斷大會(huì)上出現(xiàn)了家家展位有核酸提取的盛況。如何在這些眼花繚亂的產(chǎn)品中，選出適合我們自身需求的那一款對(duì)我們來(lái)說(shuō)也是一種極大的考驗(yàn)。

一、提取試劑盒的類型

雖然市面上病毒核酸提取試劑盒的產(chǎn)品非常多，但按照提取類型和提取方式不同大概可以分為以下幾類：

1. 提取類型

主要可以分為DNA提取、RNA提取和DNA/RNA共提取。DNA提取和RNA提取的主要區(qū)別在于：DNA易溶于高鹽、高pH，而RNA易溶于低鹽、低pH，且RNA提取還需要抑制RNase的活性。DNA/RNA共提取則需要調(diào)整一個(gè)既適合于DNA也適合于RNA的鹽濃度和pH，且抑制RNase的活性，如何將兩個(gè)需求矛盾的產(chǎn)品良好的融合在一起，也對(duì)各企業(yè)提出了更高的技術(shù)要求。

2. 提取方式

從提取方式劃分，主要可分為機(jī)提和手提。目前市面上的機(jī)提主要是磁珠法的自動(dòng)化提取，其具有自動(dòng)化程度高、操作簡(jiǎn)便、提取通量高等特點(diǎn)。手提可分為磁珠法手提和柱式法手提，適用于樣本量較少的情況。匯總比較如表1所示。

二、提取試劑盒該如何選擇？

在牧場(chǎng)條件下，病原種類較多，需檢測(cè)的樣本類型也是復(fù)雜多樣，對(duì)核酸提取試劑的適應(yīng)性就有了更高的要求。我們可以結(jié)合日常檢測(cè)的需求，選擇一款滿足自身牧場(chǎng)需要的產(chǎn)品類型。

(1) 同時(shí)滿足DNA/RNA提取

豬病毒類型多樣，如果選擇DNA或RNA單提取試劑盒，需要采購(gòu)兩種不同的試劑盒，采購(gòu)需求就會(huì)比較混亂，而且稍不注意就會(huì)混用，導(dǎo)致檢測(cè)提取的失敗，這種情況也是經(jīng)常發(fā)生，所以一款能同時(shí)滿足DNA/RNA共提取的產(chǎn)品就可以避免出現(xiàn)這種情況。

(2) 操作簡(jiǎn)便快捷、高通量

全自動(dòng)磁珠法核酸提取在幾種提取方式中是最為簡(jiǎn)單的，可以減少人工操作，減少人為誤差，并且可以高通量提取，適應(yīng)于中大型豬企每天做大量樣本檢測(cè)，但是全自動(dòng)提取設(shè)備的價(jià)格較貴。對(duì)于每天只有少量樣本檢測(cè)需求的企業(yè)來(lái)說(shuō)，磁珠手提法可以作為一個(gè)優(yōu)選，它相對(duì)柱式手提法操作更為簡(jiǎn)便，對(duì)設(shè)備要求相對(duì)更低。

(3) 提取時(shí)間短

有些時(shí)候，豬場(chǎng)對(duì)于檢測(cè)結(jié)果需求較為迫切，那么提取時(shí)間也是越短越好，以前提取產(chǎn)品時(shí)間大多數(shù)在半個(gè)小時(shí)以上，目前大部分機(jī)提法產(chǎn)品可以實(shí)現(xiàn)提取時(shí)間≤15min，這類產(chǎn)品提取時(shí)間短，同時(shí)也能保證提取效率。手提磁珠法相對(duì)柱式法，減少操作步驟，簡(jiǎn)化操作方式，提取時(shí)間更短。

(4) 提取效率是根本

對(duì)于不同的病毒類型（DNA或者RNA病毒）、不同的病毒濃度（強(qiáng)陽(yáng)、中陽(yáng)、弱陽(yáng)）、不同的樣本類型（血液、組織、環(huán)境、飼料等），都應(yīng)保證提取試劑盒具有較高的提取效率，這也是確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的重要保障。

(5) 樣本適應(yīng)性強(qiáng)

不同的病原體具有不同的組織嗜性，且排毒方式和載量也各不相同，在疫病診斷過(guò)程中，樣本類型的差別較大，并且在生物安全防控過(guò)程中檢測(cè)的樣本范圍也不再僅僅局限于宿主本身，這就導(dǎo)致了在豬場(chǎng)疫病檢測(cè)和監(jiān)測(cè)過(guò)程中，遇到的樣本類型會(huì)更加復(fù)雜。對(duì)于磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒而言，裂解液的優(yōu)化、磁珠的選擇以及兩者之間的搭配，是決定其是否具有良好的樣本適用性的關(guān)鍵因素。

三、日常遇到的小問(wèn)題

由于核酸提取技術(shù)得到廣泛的應(yīng)用，在日常檢測(cè)中也遇到了很多有趣的問(wèn)題，今天小編也選取了幾個(gè)常見(jiàn)的問(wèn)題，跟大家簡(jiǎn)單聊一聊。

問(wèn)題一、當(dāng)前用量最大的新冠專用提取試劑盒和非瘟用提取試劑盒有什么區(qū)別？

(1) 提取病毒類型和大小的不同。SARS-CoV-2屬于RNA病毒，基因組大小約為30kb；ASFV屬于DNA病毒，基因組大小為170~193kb；兩者提取的技術(shù)難度有很大區(qū)別。

(2) 樣本類型的差異。SARS-CoV-2的樣本主要是咽拭子、鼻拭子和環(huán)境樣本，樣本類型相對(duì)單一；ASFV的樣本包括全血、血清、血漿、唾液、精液、鼻咽拭子、環(huán)境、組織、糞便、飼料等，樣本類型紛繁復(fù)雜。

當(dāng)前牧場(chǎng)用提取試劑盒雖然有廣泛的適應(yīng)性，但難免也會(huì)碰到很多問(wèn)題，小編將ASFV提取中經(jīng)常遇到的樣本適用性差的現(xiàn)象和原因總結(jié)如下，可供大家參考：

問(wèn)題二、不加蛋白酶K，會(huì)影響病毒DNA/RNA的提取效率嗎？

在核酸提取中，蛋白酶K的主要作用是：消化蛋白，尤其是消化核酸-蛋白復(fù)合體中的蛋白，從而使核酸釋放。真核生物細(xì)胞核中的核酸大部分是以染色體的形式存在，在提取真核生物DNA時(shí)，如果不加蛋白酶K，提取總量會(huì)大大降低。而病毒的結(jié)構(gòu)相對(duì)比較簡(jiǎn)單，主要由蛋白外殼和擬核組成，無(wú)染色體結(jié)構(gòu)，且核酸含量相對(duì)較少。所以，對(duì)于病毒DNA/RNA，通過(guò)優(yōu)化提取試劑盒的裂解細(xì)胞、變性蛋白以及去除雜質(zhì)的能力，完全可以做到不使用蛋白酶K，也能保證較高的提取效率。

問(wèn)題三、樣本量越多，提取得到的核酸豈不是越多？

樣本量增加，如果相應(yīng)的裂解液、結(jié)合液以及吸附核酸的介質(zhì)液相應(yīng)增加，提取到的核酸也會(huì)相應(yīng)增多。但對(duì)于磁珠法預(yù)分裝試劑而言，增加樣本量，相應(yīng)的裂解結(jié)合液、磁珠沒(méi)有增加，即相應(yīng)的裂解、結(jié)合能力沒(méi)有提高，提取到的核酸有可能不會(huì)增加反而減少，而且增加樣本量會(huì)使2.2mL深孔板內(nèi)總體積增加，提取時(shí)存在溶液溢出造成混樣的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于柱式法而言，如果只是增加樣本量，提取效果也可能會(huì)適得其反。

問(wèn)題四、核酸提取效率如何評(píng)價(jià)？

(1) 用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來(lái)測(cè)定核酸提取試劑盒的提取靈敏度；

(2) 與市面上認(rèn)可度較高的提取試劑盒對(duì)比提取真實(shí)的病毒樣本，分別提取不同樣本類型的強(qiáng)陽(yáng)、中陽(yáng)、弱陽(yáng)樣本，比較兩者的Ct值。

我們通過(guò)測(cè)評(píng)市面上很多提取產(chǎn)品過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，核酸提取試劑盒的質(zhì)量差異較大，差異不單單是體現(xiàn)在提取的效率，還有樣本的適應(yīng)性上面。這就要求我們自身要提高檢驗(yàn)產(chǎn)品質(zhì)量的能力，從而選出一款真正適應(yīng)牧場(chǎng)檢測(cè)需求的產(chǎn)品。